Princípios de HPLC (3)

Modos de separação

Princípio da separação

Em HPLC, componentes são separados através do emprego de uma coluna com base no grau de interação entre uma molécula e a fase estacionária, sendo assim, componentes com baixa interação eluem primeiro sendo o seu oposto verdadeiro. Alguns tipos de interação incluem adsorção, interações hidrofílicas e hidrofóbicas, troca iônica, penetração e exclusão, como demonstra a figura 6.

Tipos de coluna e modos de separação

Como apresentado na tabela 2, existem muitos tipos de colunas e técnicas de operação. O segredo de uma separação está na escolha correta de um modo de separação, com base na natureza dos analitos a serem separados. Pode-se empregar por exemplo, solventes orgânicos fortes para trabalhos em fase normal com colunas de sílica sem funcionalização, para a separação de compostos lipossolúveis.

Fases móveis contendo água, metanol, acetonitrila e até mesmo tetrahidrofurano em baixas concentrações podem ser trabalhadas, de modo a separar analitos via interações hidrofóbicas em fase reversa.

Outros modos de separação envolvem o tamanho de poros de uma fase estacionária e o diâmetro hidrodinâmico de macromoléculas, para estudos envolvendo GPC e capacidade de troca iônica, para separação de compostos em cromatografia iônica.

Tabela 2 tipos de coluna e modos de separação

Modo	Fase estacionária	Fase móvel	Interação	Qualidades
Fase normal	Silica gel Silica NH2, CN,…	Solvent orgânico	adsorção	Separação de compostos lipossolúveis
Fase reversa	Silica C18, C8, CN, fenil…	água / metanol	hidrofóbica	Primeira opção, mais comum.
GPC (não aquoso)	Polímero hidrofóbico	Solvent orgânico	Permeação em gel	Medição de distribuição de massa molecular
GFC (aquoso)	Polímero hidrofílico	Tampão	Filtração em gel	Medição de distribuição de massa molecular, estudo de biopolímeros,…
Troca iônica	Trocadores iônicos	Tampão	Afinidade eletrostática	Separação de compostos iônicos

Fase normal x reversa

Métodos em fase normal e reversa apresentam perfis de eluição completamente diferentes. Em cromatografia de fase normal, um solvente de baixa polaridade atravessa um empacotamento de alta polaridade, assim, observa-se baixa retenção de compostos de mesma natureza que o solvente.

Na técnica de fase reversa, trabalha-se com solventes e fases estacionárias específicos, de modo a reter preferencialmente compostos hidrofóbicos.

Eluição isocrática x gradiente

Na cromatografia em fase reversa ou iônica, o gradiente de eluição pode ser empregado para melhoria de uma separação ou redução de tempo de corrida. No exemplo a seguir, o ácido clorogênico e a rutina podem ser separados em uma coluna ODS com uma solução metanol/1% ácido acético.

Na figura 7, observam-se dois métodos isocráticos: o primeiro (esquerda superior) não apresenta boa separação entre os analitos que estão eluindo no início da corrida e o segundo (esquerda inferior) leva muito tempo. No entanto, ao empregar um gradiente de 30% até 45% de metanol (figura 7, à direita) observa-se um cromatograma com resolução adequada às exigências do operador sem retenções exacerbadas.