Na maioria dos casos, a identificação de um analito em uma amostra é realizada através da comparação de um tempo de retenção com um padrão analítico. Se um cromatograma complexo com muitos sinais é obtido ou se há variação de retenção do pico de interesse entre amostras e padrão analítico, pode-se dopar a amostra com padrão, como demonstra a figura 11.
É possível realizar a coleta de algumas frações. Desta maneira é possível utilizar equipamentos para a caracterização desta fração e assim identificar um pico desconhecido ou assegurar a identidade de um produto isolado.
Existem dois métodos de quantificação: métodos com padrões externos e internos, ambos desenvolvidos através de uma curva de calibração. No método de padrão externo cria-se uma curva de calibração com base em uma amostra padrão, com quantificação de amostras desconhecidas. No método de padrão externo cria-se uma curva de calibração através de uma quantidade fixa de “padrão interno” que é adicionada às amostras, assim faz-se uma curva de calibração de concentração por razão de áreas de pico para quantificação.
Como apresentado na figura 12, a substância utilizada como “padrão interno” deve ser uma amostra que não se encontra na amostra, de maneira a gerar um sinal completamente separável em relação aos outros picos do cromatograma. Além disso, é recomendável que a sua eluição seja próxima do analito de interesse, quimicamente e fisicamente estável e altamente puro.
A principal vantagem do padrão interno é que ele previne erros experimentais como alteração de volumes de injeção ou evaporação de solvente.
Passo 1: estabelecer objetivos de análise e investigar analitos de interesse
1. Peso e estrutura molecular, bem como os grupos funcionais de cada analito
2. Propriedades (solubilidade, estabilidade, espectro de UV/Vis e fluorescência, etc.)
3. Estado da amostra (concentração, conteúdo, impurezas, ...)
4. Estudo preliminar de separação, condições de análise e preparo de amostras disponíveis em literaturas, farmacopeias, métodos similares desenvolvidos in-house, etc.)
Passo 2: considerações sobre o método cromatográfico
1. Confirmação de tempo de retenção do analito de interesse através do uso de padrões analíticos
2. Medição de concentrações de interesse, determinação de detector, avaliação de necessidade de preparo de amostras
3. Localização de analitos de interesse e interferentes em uma amostra desconhecida
Passo 3: determinação de condições de trabalho para a rotina
1. Determinação da linearidade e tipo de curva de calibração
2. Avaliação de reprodutibilidade incluindo as etapas de tratamento de amostras
3. Confirmação de componentes fortemente retidos em coluna ou não observados em certos detectores
4. Estabelecimento de correlações com outros métodos quantitativos, se houver.
Passo 4: rotina
1. Avaliação de vida útil da coluna
2. Avaliação de custo de operação
3. Elaboração de procedimento de operação padrão e documentação necessária
4. Avaliação de manutenção de sistema
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