O método de derivatização pré-coluna para análise de aminoácidos modifica quimicamente os aminoácidos antes da separação em uma coluna, como a C18, seguido por detecção fluorescente. O ortoftaldeído (OPA) é amplamente usado para derivatizar aminoácidos primários, mas não reage com aminoácidos secundários, como a prolina, essencial em proteínas e presente em alimentos e bebidas. Para esses casos, o cloroformato de 9-fluorenilmetila (FMOC) é utilizado.
Um método combinado com OPA e FMOC resolve essas limitações: OPA derivatiza aminoácidos primários e FMOC os secundários. Derivados fluorescentes são detectados alternando automaticamente os comprimentos de onda. A automação do amostrador automático permite dispensação, mistura e agitação das soluções.
Nesta aplicação, 22 aminoácidos foram separados e analisados com sucesso por meio de derivatização pré-coluna online utilizando OPA e FMOC, empregando um sistema de HPLC da Jasco. O sistema é composto pela bomba binária PU-4185, o injetor automático AS-4150, o forno de coluna CO-4060 e o detector de fluorescência FP-4020, garantindo precisão e eficiência na análise.
O procedimento de derivatização pré-coluna foi realizado utilizando amostrador automático AS-4150. Esse procedimento começa com a preparação da amostra em um frasco de mistura. Inicialmente, são adicionados 90 µL de solução de ácido 3-mercaptopropiônico (3-MPA), 44 µL de solução de OPA e 15 µL da amostra. O conteúdo é misturado utilizando um sistema Air-Bubble Induced Mixing para garantir a homogeneidade e, em seguida, é deixado em repouso por 1 minuto para permitir a reação inicial entre o OPA e os aminoácidos primários.
Após esse período, adicionam-se 20 µL de solução de FMOC à mistura, seguida de nova homogeneização. A solução é deixada em repouso por mais 2 minutos, permitindo que o FMOC reaja completamente com os aminoácidos secundários, como a prolina.
Com a derivatização concluída, a amostra está pronta para ser injetada no sistema de HPLC, onde os aminoácidos derivatizados serão separados e analisados por detecção por fluorescência, garantindo resultados precisos e confiáveis. A Figura 1 mostra o cromatograma de uma solução padrão de aminoácidos que contém 100 µmol/L de 22 aminoácidos diferentes.
Condições Cromatográficas | |
Coluna: | C18 (75 x 3,0 mm, 1,9 µm) |
Fase Móvel: | A) Tampão de fosfato de potássio 20 mM (pH 6,9)
B) Acetonitrila/Metanol/Água (45/40/15) |
Gradiente: | Fase Móvel A / Fase Móvel B = 89/11 (0,0 min) → 87/13 (3,0 min) → 69/31 (5,0 min) → 63/37 (7,0 min) → 30/70 (11,0 min) → 0/100 (11,5 min) → 0/100 (14,5 min) → 89/11 (15,0 min), 1 ciclo; 20 minutos |
Fluxo: | 0,8 mL/min |
Temperatura da Coluna: | 35 °C |
Comprimento de onda: | Ex. 340 nm, Em. 450 nm → Ex. 266 nm, Em. 305 nm (10,5 min) (Ganho x10) |
Volume de Injeção: | 1 µL |
Figura 1: Cromatograma da solução padrão contendo 22 aminoácidos diferentes, com concentração de 100 µmol/L para cada aminoácido. A identificação dos picos é a seguinte:
1: ácido aspártico, 2: ácido glutâmico, 3: asparagina, 4: serina, 5: glutamina, 6: histidina, 7: glicina, 8: treonina, 9: citrulina, 10: arginina, 11: alanina, 12: GABA, 13: tirosina, 14: cistina, 15: valina, 16: metionina, 17: triptofano, 18: fenilalanina, 19: isoleucina, 20: leucina, 21: lisina, 22: prolina.
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