Determinação da estrutura secundária de proteínas por Dicroísmo Circular

A estrutura de ordem superior (HOS, do inglês “Higher Order Structure”) é um atributo crítico que controla a função, segurança e eficácia de proteínas terapêuticas. Durante o desenvolvimento de proteínas terapêuticas, a caracterização da HOS é necessária para alcançar processos de fabricação robustos, desenvolver formulações estáveis e fabricar biossimilares idênticos ao produto inovador. Ao investigar a HOS de proteínas, o Dicroísmo Circular (CD, do inglês “Circular Dichroism”) é a técnica mais conhecida para estudar a estrutura secundária de proteínas. Este método é fácil, economiza tempo e é comumente utilizado para monitorar o efeito das condições de fabricação, formulação e armazenamento em proteínas terapêuticas.

A espectroscopia de CD é uma técnica clássica para a previsão da estrutura secundária de proteínas em solução. O conteúdo da estrutura secundária é estimado com base nos sinais de CD na região do UV distante (170 a 250 nm), que estão associados às transições eletrônicas envolvendo ligações peptídicas. A concentração de proteína necessária para detectar o sinal mínimo de CD nessa faixa é baixa: aproximadamente 0,1 mg/mL ao utilizar uma cubeta com comprimento de caminho óptico de 1 mm. Isso é uma grande vantagem quando a quantidade de proteína é limitada, o que é comum.

Neste post, apresentamos o estudo da determinação da estrutura secundária do Herceptin® (trastuzumabe), um anticorpo monoclonal amplamente utilizado no tratamento de câncer HER2-positivo. A análise foi realizada utilizando o espectrômetro de Dicroísmo Circular J-1500, da Jasco. Os espectros de CD e de absorbância na região do UV distante foram obtidos simultaneamente (Figs. 1a e 1b). Para a previsão da estrutura secundária, o espectro de CD foi normalizado com base na absorbância ou na concentração da amostra, permitindo a geração do espectro de Elipticidade Média Residual (MRE) ou do espectro de CD molar. Neste estudo, a normalização foi realizada utilizando a absorbância em 205 nm, resultando no espectro MRE (Fig. 1c).

Por fim, a composição da estrutura secundária foi determinada com alta precisão utilizando o software BeStSel (Fig. 1d), confirmando a eficiência da combinação de espectroscopia de CD com ferramentas de análise avançada para caracterizar proteínas terapêuticas.

Figura 1: a) CD, b) absorbância, c) espectro de MRE na região do UV distante, e d) composição das estruturas secundárias.

Conclusões

A estrutura secundária do Herceptin® foi facilmente predita a partir do espectro de CD utilizando o BeStSel. A espectroscopia de CD é a abordagem mais forte e rápida para determinar a estrutura secundária de proteínas. A simplicidade dessa técnica a torna aplicável para a triagem eficiente de soluções proteicas sob diferentes condições, como composição do tampão ou temperatura, para determinar seus efeitos na estabilidade estrutural da proteína.

Referências Bibliográficas

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