Tianeptina: Avaliação de enantiômeros por HPLC e Dicroísmo Circular Vibracional (VCD)

Introdução

A depressão é um dos transtornos neurobiológicos mais comuns no mundo, afetando concentração, energia, ansiedade e humor. Antidepressivos tricíclicos, como imipramina e amitriptilina, são eficazes, mas apresentam toxicidade cardiovascular significativa. A Tianeptina, um antidepressivo tricíclico com estrutura distinta (núcleo dibenzo-[c,f][1,2]tiazepina S,S-dióxido e cadeia lateral de ácido aminoheptanoico), apresenta meia-vida curta e rápida eliminação, com efeitos cardiovasculares mínimos. Sua molécula possui um carbono quiral, gerando um par de enantiômeros R/S, ainda pouco estudados quanto a diferenças terapêuticas e toxicológicas.

Métodos recentes de separação enantiosseletiva utilizando RHPLC com colunas quirais core–shell de 2,7 μm permitem separar os enantiômeros R- e S-Tianeptina em menos de cinco minutos, com a mesma ordem de eluição confirmada por dicroísmo circular (CD), oferecendo uma ferramenta analítica para estudos futuros sobre a razão enantiomérica.

Experimental

A separação dos enantiômeros da Tianeptina foi realizada em duas colunas quirais, NicoShell e WhelkoShell, acopladas a um detector de dicroísmo circular (CD) da Jasco (CD-4095). Para a NicoShell, a fase móvel foi metanol HPLC, ácido acético e hidróxido de amônio (100:0,35:0,05 v/v) com vazão de 0,425 mL/min. Para a WhelkoShell em fase normal, a fase móvel foi hexanos:etanol (50:50 v/v) com vazão de 1 mL/min e detecção UV a 254 nm.

O estudo utilizou o sistema modular de HPLC da Jasco, composto pelos seguintes módulos:

Resultados

Atribuição de estrutura molecular e configuração absoluta da Tianeptina

A Tianeptina possui anel heterocíclico de sete membros contendo enxofre e nitrogênio, ligado a uma cadeia lateral de ácido carboxílico de sete carbonos, apresentando um carbono quiral que gera os enantiômeros R e S (Figura 1). Para atribuir a configuração absoluta, os isômeros foram separados por cromatografia preparativa quiral utilizando uma coluna WhelkoShell com fase móvel etanol:hexano 50:50 v/v.

A caracterização da configuração absoluta foi realizada por dicroísmo circular vibracional (VCD) empregando o espectrômetro FVS-6000 da Jasco, que detecta a absorção diferencial de luz polarizada circularmente por moléculas quirais. Comparando os espectros experimentais com modelos estereoquímicos calculados, foi possível determinar de forma inequívoca a configuração absoluta da Tianeptina.

Desenvolvimento de método quiral para enantiômeros de Tianeptina

Conforme mencionado na introdução, não havia métodos publicados para a separação dos enantiômeros da Tianeptina na literatura química, exceto por um estudo. Uma varredura UV-Vis preliminar de um padrão de Tianeptina em metanol foi realizada para auxiliar na seleção de comprimentos de onda em detectores CD e PDA no sistema de HPLC, caso impurezas nas amostras reais causassem interferências. As amostras de Tianeptina, geralmente apresentam coloração devido a aditivos de cúrcuma.

O comprimento do caminho da cubeta de quartzo era de 1 cm. Os espectros em branco foram obtidos usando metanol puro, que constitui a maior parte da fase móvel. Uma solução estoque de Tianeptina de 2 mg/mL em metanol foi diluída aproximadamente 40 vezes e 100 vezes para gerar os espectros verde e roxo na Figura 2A, respectivamente. A Figura 2B mostra uma inserção ampliada do espectro UV-Vis, com um máximo em 210 nm, seguido por um ombro em 230 nm e uma faixa de menor intensidade em 285 nm.

Para fins analíticos, duas químicas de colunas quirais com ampla seletividade para diferentes classes de moléculas foram investigadas com base nos grupos funcionais presentes nas moléculas. Uma das químicas de coluna que separou os enantiômeros da Tianeptina foi a WhelkoShell (Figura 2C). Esta fase estacionária é normalmente recomendada para modo de fase normal; no entanto, demonstramos aqui que o modo iônico polar (usando metanol puro com aditivos) também funciona na WhelkoShell. O seletor quiral ligado é um 1-(3,5-dinitrobenzamido)-1,2,3,4-tetrahidrofenantreno com configuração (S,S), cuja cavidade em forma de fenda é crucial para a enantiosseletividade.

A segunda química de coluna é a NicoShell, um glicopeptídeo macrocíclico proprietário ligado a partículas de sílica superficialmente porosa, que apresenta boa seletividade para compostos básicos. Como a Tianeptina contém funcionalidades ionizáveis (uma amina secundária e um ácido carboxílico) e pode formar ligações de hidrogênio, seus enantiômeros foram resolvidos em uma coluna NicoShell em condições iônicas polares, na presença de ácido acético e hidróxido de amônio como modificadores da fase móvel, conforme mostrado na Figura 2D.

Como o volume da célula do detector CD é de 40 μL, o efeito extra-coluna reduz ligeiramente a resolução; no entanto, o objetivo era confirmar as direções opostas (picos positivos e negativos) dos sinais de CD para os padrões de Tianeptina (Figura 2E–F). Esse compromisso de resolução com uma célula grande não é mais um problema, pois a modelagem de picos permite extrair o perfil verdadeiro do pico, mesmo que haja ligeira sobreposição. O detector CD confirma que químicas de coluna separadas e diferentes sistemas eluentes produzem a mesma ordem de eluição dos enantiômeros da Tianeptina.

O estudo também abordou a extração de Tianeptina de amostras complexas, como cápsulas em pó e produtos líquidos com aditivos que poderiam interferir na análise, utilizando etanol e procedimentos de sonicação, centrifugação e filtração para obter a extração completa do fármaco. Em seguida, a quantificação dos enantiômeros foi realizada com o sistema de HPLC da Jasco equipado com detector PDA, permitindo determinar o teor total de Tianeptina e a proporção dos enantiômeros.

Para mais detalhes sobre os procedimentos e resultados, baixe a aplicação completa:

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