Quantificação de DNA por fluorescência usando apenas uma gota de amostra

A quantificação de ácidos nucleicos é uma etapa fundamental em diversas rotinas de biologia molecular, incluindo preparo de bibliotecas para sequenciamento, PCR, análise genômica e controle de qualidade de amostras. Em muitos casos, o volume disponível de amostra é limitado, o que torna essencial utilizar técnicas analíticas capazes de fornecer alta sensibilidade utilizando quantidades mínimas de material.

Uma abordagem eficiente para esse tipo de análise é a utilização de acessórios de microamostragem por fluorescência, que permitem realizar medições precisas com volumes extremamente reduzidos. O acessório da Jasco, o One Drop SAF-151 foi desenvolvido exatamente com esse objetivo: possibilitar medições espectrais ou quantitativas de proteínas e ácidos nucleicos utilizando apenas uma gota de amostra, dispensando o uso de cubetas convencionais.

Nesse sistema, uma única gota de aproximadamente 5 µL é depositada diretamente na célula de medição a partir de uma pipeta, permitindo medições rápidas e reprodutíveis com preparo mínimo da amostra. Essa abordagem reduz significativamente o consumo de material e facilita a análise sequencial de múltiplas amostras.

 

 

 

O acessório é totalmente compatível com a série FP-8000, incluindo o FP-8250, oferecendo uma solução versátil para aplicações em biologia molecular, bioquímica e ciências da vida.

Neste estudo, demonstramos a aplicação do acessório One Drop para obtenção de dados de fluorescência e construção de uma curva de calibração de λDNA marcado com PicoGreen®, avaliando parâmetros importantes como linearidade e reprodutibilidade das medições.

 

Parte Experimental

 

Materiais e método

A análise foi realizada utilizando o espectrofluorímetro FP-8250 equipado com o acessório One Drop SAF-151.

O corante fluorescente PicoGreen foi utilizado para marcar o λDNA, permitindo a detecção sensível do ácido nucleico por fluorescência.

Foram preparadas soluções contendo diferentes concentrações de λDNA marcado com PicoGreen®, cobrindo uma faixa ampla de concentração para avaliação da linearidade do método.

Para cada análise, 5 µL de amostra foram depositados diretamente na célula do acessório One Drop utilizando uma micropipeta. As medições foram realizadas no modo de emissão, registrando o espectro de fluorescência das amostras.

 

 

Parâmetros de medição

 

Parâmetro	Condição
Modo de medição	Emissão
Comprimento de onda de excitação	480 nm
Comprimento de onda de emissão	523 nm
Largura de banda (excitação)	20 nm
Largura de banda (emissão)	20 nm
Tempo de resposta	1 s
Sensibilidade	620 V

 

 

 

 

 

One Drop SAF-151

 

 

 

Espectrofluorímetro FP-8250

 

 

Resultados e Discussão

Espectros de fluorescência

Os espectros de fluorescência obtidos para diferentes concentrações de λDNA marcado com PicoGreen® indicaram que o máximo de emissão ocorre em 523 nm, conforme esperado para esse sistema fluorescente.

O aumento da concentração de DNA resultou em um aumento proporcional da intensidade de fluorescência, demonstrando o comportamento típico de sistemas fluorescentes utilizados em quantificação de ácidos nucleicos.

 

Figura 1. Espectros de fluorescência do λDNA marcado com PicoGreen®

 

Curva de calibração

Utilizando os valores médios obtidos para cada concentração, foi construída uma curva de calibração relacionando intensidade de fluorescência e concentração de λDNA.

 

Figura 2. Curva de calibração do λDNA marcado com PicoGreen®

 

A regressão linear apresentou:

• Coeficiente de correlação (R): 0,9999
• Erro padrão: 6,819

 

Esses resultados demonstram excelente linearidade do método, confirmando que o sistema é adequado para quantificação precisa de DNA em uma ampla faixa de concentração.

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