Princípios de espectroscopia de fluorescência (4)
Princípios de espectroscopia de fluorescência (3)
6 de outubro de 2020Princípios de espectroscopia de fluorescência (5)
6 de outubro de 2020Princípios de espectroscopia de fluorescência (4)
Notas sobre medições em fluorescência
Extinção de fluorescência
Extinção por oxigênio diluído
A intensidade de fluorescência do naftaleno e do antraceno é reduzida ao longo do tempo, devido ao oxigênio dissolvido. De maneira a prevenir este tipo de evento, deve-se remover o gás oxigênio através da utilização de gás nitrogênio ou trabalhar sob vácuo.
Extinção térmica
De maneira geral, a intensidade de fluorescência reduz de acordo com o aumento de temperatura. Neste caso, o controle de temperatura se torna parte essencial durante este tipo de ensaio, sendo um parâmetro mais importante nesta técnica do que outros tipos de medições que envolvem absorção de luz.
Extinção por concentração
Em muitas soluções fluorescentes, observa-se redução de intensidade em altas concentrações. De maneira similar à uma “blindagem interna”, mas com mecanismos diferentes, é possível afirmar que estes eventos ocorrem devido a interações intermoleculares. Apesar disso, alguns analitos como a pseudocianina só emitem fluorescência quando em alta concentração.
Extinção por impurezas
Quando a pureza do solvente ou reagente utilizado é baixa, é possível que se observe perda na precisão dos resultados devido a interações entre impurezas e analito de interesse.
Efeito de blindagem interna
No caso de amostras em alta concentração, a luz de excitação é fortemente absorvida na região próxima à superfície da célula e não atinge o interior da célula. Este tipo de evento é conhecido como efeito de blindagem interna, o que causa distorções de pico. A figura 10 apresenta o espectro de excitação de uma solução diluída e de uma concentrada de sulfato de quinina.
O espectro de excitação da solução concentrada é uma convolução do espectro de excitação da solução diluída e o espectro de transmissão da amostra concentrada.
Correção espectral
Na espectroscopia UV/Vis, a escala fotométrica é padronizada como 0 a 100% de transmitância. Em espectroscopia por fluorescência, não há escala de referência, mas sim medidas relativas. Adicionalmente, a intensidade de fluorescência detectada é o produto da intensidade de fluorescência de amostra e uma função do instrumento, que opera de maneira similar à linha de base em espectroscopia UV/Vis. De maneira a obter um “espectro verdadeiro”, é necessário corrigir o espectro observado, através da remoção do efeito da função do instrumento.
