Princípios de espectroscopia de fluorescência (2)
Princípios de espectroscopia de fluorescência (1)
6 de outubro de 2020Princípios de espectroscopia de fluorescência (3)
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Espectroscopia de absorção X espectroscopia de emissão
A figura 4 apresenta uma configuração típica de um espectrofotômetro UV/Vis e de um espectrofluorímetro. Ambos apresentam uma amostra que é irradiada com luz monocromática, oriunda de uma fonte de luz que é passada através de um monocromador. O detector no caso de UV/Vis detecta a luz que atravessa a amostra (espectroscopia de absorção). Por outro lado, um espectrofluorímetro detecta luz fluorescente emitida em uma direção a 90º, que atinge um detector após atravessar um monocromador de emissão (espectroscopia de emissão).Fig. 4 UV/Vis spectrometer (top) and spectrofluorometer (bottom)
No espectro de emissão, o comprimento de onda de emissão (Em) é fixo e o de excitação (Ex) é submetido à uma varredura, de maneira a medir a intensidade de fluorescência. O comprimento de onda que promove a intensidade de fluorescência máxima é determinado como comprimento de onda de excitação máxima. O formato do espectro de excitação é similar ao espectro de absorção (figura 5).
Um espectro de fluorescência é obtido ao se fixar o comprimento de onda Ex e realizando-se a varredura dos comprimentos de onda Em. Apesar da variação da intensidade de fluorescência de acordo com o comprimento de onda de excitação, pode-se perceber que os perfis espectrais são similares (figura 5).
Fig. 5-1 Absorption spectrum and excitation spectrum
Fig. 5-2 Fluorescence spectra at different excitation wavelengths
Fig. 6 Franck-Condon absorption spectrum: vibration levels in excited and ground states (top),
mirror image relationship between absorption and fluorescence spectra (bottom)
Vantagens da espectroscopia por fluorescência
- Alta sensibilidade
Espectroscopia de absorção percebe reduções de intensidade de luz incidente, ao passo que a espectroscopia de fluorescência detecta a intensidade de luz emitida. Trata-se de um modelo mais sensível pois detecta diferenças com base em uma intensidade de emissão inicial igual a zero.
- Alta seletividade
Marcações fluorescentes específicas são possíveis ao se ligar moléculas fluorescentes à analitos de interesse.
- Alta dependência de ambiente
O sinal e formato de um espectro de fluorescência é sensível ao ambiente no qual um analito se encontra (pH de solução, temperatura, tipo de solvente, presença de sais). Esta característica pode ser utilizada a favor do pesquisador, de modo a realizar análises do ambiente que envolve um analito em particular.
Informações moleculares que podem ser obtidas através
do emprego de espectroscopia de fluorescência:
- Quantificação de analitos
- Comprimento de excitação ótimo
- Informação sobre o ambiente que envolve um analito específico (pH de solução, temperatura, tipo de solvente, presença de sais).
- Tempo de vida de fluorescência e fosforescência
- Despolarização
- Rendimento quântico
