Princípios de HPLC (1)

HPLC é a abreviação de cromatografia líquida de alta performance. Neste contexto, um cromatógrafo é o equipamento que desenvolve a técnica de cromatografia, de maneira a obter-se um cromatograma. Esta técnica trata de separar analitos que se encontram juntos em uma mistura, de modo a obter resultados qualitativos e/ou quantitativos.

O início da cromatografia

Métodos para separar misturas de compostos envolvem extrações, filtrações e destilações. A cromatografia foi inventada por Tswett no início de 1900. Neste caso, uma coluna empacotada com carbonato de cálcio foi carregada com um extrato oriundo de plantas e exposta à uma fase móvel de éter de petróleo (figura 2).

Pigmentos foram observados individualmente, como faixas coloridas. Por esta razão, Tswett nomeou esta técnica como cromatografia do grego “chroma” (cor) e “grafein” (escrita). A técnica de HPLC é uma técnica mais moderna, onde empregam-se “colunas analíticas” para o desenvolvimento de análises em curtos tempos de duração sob alta pressão.

Mecanismo de separação em cromatografia

Uma mistura é injetada na corrente de líquido que viaja através do sistema (figura 3), conhecido como fase móvel, que segue em direção à um meio sólido (um leito empacotado) que é conhecido como fase estacionária. Os componentes misturados à fase móvel interagem com a fase estacionária sendo a velocidade de viagem de um grupo de moléculas determinada pela intensidade da sua interação intermolecular com a fase estacionária. Em outras palavras, analitos que interagem fortemente com uma fase estacionária apresentarão forte retenção, sendo o oposto igualmente verdadeiro.

Os componentes separados podem ser analisados através de diferentes detectores. O detector UV, por exemplo, pode ser empregado para o estudo de componentes que absorvem luz na faixa de UV, de modo a proporcionar um cromatograma de intensidade de absorbância (eixo Y) pelo tempo de análise (eixo x). Neste caso, pode-se criar uma curva de calibração através do emprego de um padrão com analitos conhecidos em concentrações preestabelecidas e avaliar amostras desconhecidas de maneira a obter resultados qualitativos (detecção de analito na amostra) e quantitativos (dosagem do componente).