Princípios de microespectroscopia (2)

Técnicas espectroscópicas tradicionais foram adaptadas para o segmento de microespectroscopia. As espectroscopias de absorção UV-Vis, fluorescência, espalhamento Raman e infravermelho são exemplos que podem ser encontrados na tabela 1. A absorção UV-Vis mede a absorbância de uma amostra e é adequada para a obtenção de espectros de materiais que contenham grupos cromóforos. Em métodos envolvendo fluorescência, usualmente empregam-se sondas marcadas com grupos fluoróforos para que se execute o trabalho. Em Espectroscopia de absorção infravermelho analisam-se moléculas de acordo com determinados modos de vibração molecular. O espalhamento Raman considera modos de vibração de maneira similar à espectroscopia de absorção infravermelho considerando agora a questão de “polarizabilidade de ligações”.

A aplicação em conjunto da microscopia e espalhamento Raman rendem uma boa resolução espacial apesar da baixa intensidade. O oposto é verdadeiro para a aplicação sinérgica entre microscopia e espectroscopia infravermelho. As duas técnicas são consideradas como complementares.

Tabela 1. Tipos e qualidade de microespectroscopia

Resolução espacial em microespectroscopia

Existem dois tipos de objetivas para microespectroscopia: lentes objetivas “visíveis” e cassegrains. Seu tipo e uso depende da aplicação (figura 1). Para as técnicas de UV-Vis, fluorescence e Raman, objetivas utilizadas em microscópios comuns podem ser utilizadas. No entanto, cassegrains são necessários para a microespectroscopia FTIR.

A resolução espacial é importante no segmento de microespectroscopia porque define o grau de detalhamento da imagem obtida. No caso de lentes objetivas, a resolução espacial é de 0.61 x λ/N.A enquanto cassegrains atingem 2.2 × λ/N.A, onde “N.A” representa a abertura numérica e λ o comprimento de onda da luz que a atravessa.

A Resolução espacial também aumenta conforme diminui-se o comprimento de onda. A Tabela 2 informa a área observável mínima para cada método de microespectroscopia.

Tabela 2: tipos de microscopias e áreas de observação

Imageamento e mapeamento

A criação de uma imagem espectroscópica de uma amostra pode ser feita tanto por mapeamento quanto imageamento. Primeiro a imagem visual da amostra deve ser obtida. Nos sistemas modernos, utiliza-se imagens de CCD. O grau de magnificação da imagem é determinado pelas lentes objetivas e a posição da amostra é ajustada por um estágio XY para a configuração do campo de visualização. O mapeamento é a varredura automática em um campo de visão de modo que se realiza uma medição em pontos múltiplos. Estes pontos geram pixels individuais que compõem uma imagem espectroscópica. O Imageamento pode ser realizado também através da coleta simultânea de informações em pontos múltiplos utilizando um detector CCD de arranjo linear para UV-Vis, fluorescência e Raman e um MCT com arranjo linear para FTIR (figura 2). A imagem espectroscópica pode ser formada através da seleção de um comprimento de onda e a avaliação da intensidade deste sinal ao longo de uma amostra.

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