Quantificação de DNA por fluorescência usando apenas uma gota de amostra

A quantificação de ácidos nucleicos é uma etapa fundamental em diversas rotinas de biologia molecular, incluindo preparo de bibliotecas para sequenciamento, PCR, análise genômica e controle de qualidade de amostras. Em muitos casos, o volume disponível de amostra é limitado, o que torna essencial utilizar técnicas analíticas capazes de fornecer alta sensibilidade utilizando quantidades mínimas de material.

Uma abordagem eficiente para esse tipo de análise é a utilização de acessórios de microamostragem por fluorescência, que permitem realizar medições precisas com volumes extremamente reduzidos. O acessório da Jasco, o One Drop SAF-151 foi desenvolvido exatamente com esse objetivo: possibilitar medições espectrais ou quantitativas de proteínas e ácidos nucleicos utilizando apenas uma gota de amostra, dispensando o uso de cubetas convencionais.

Nesse sistema, uma única gota de aproximadamente 5 µL é depositada diretamente na célula de medição a partir de uma pipeta, permitindo medições rápidas e reprodutíveis com preparo mínimo da amostra. Essa abordagem reduz significativamente o consumo de material e facilita a análise sequencial de múltiplas amostras.

O acessório é totalmente compatível com a série FP-8000, incluindo o FP-8250, oferecendo uma solução versátil para aplicações em biologia molecular, bioquímica e ciências da vida.

Neste estudo, demonstramos a aplicação do acessório One Drop para obtenção de dados de fluorescência e construção de uma curva de calibração de λDNA marcado com PicoGreen®, avaliando parâmetros importantes como linearidade e reprodutibilidade das medições.

Parte Experimental

Materiais e método

A análise foi realizada utilizando o espectrofluorímetro FP-8250 equipado com o acessório One Drop SAF-151.

O corante fluorescente PicoGreen foi utilizado para marcar o λDNA, permitindo a detecção sensível do ácido nucleico por fluorescência.

Foram preparadas soluções contendo diferentes concentrações de λDNA marcado com PicoGreen®, cobrindo uma faixa ampla de concentração para avaliação da linearidade do método.

Para cada análise, 5 µL de amostra foram depositados diretamente na célula do acessório One Drop utilizando uma micropipeta. As medições foram realizadas no modo de emissão, registrando o espectro de fluorescência das amostras.

Parâmetros de medição

One Drop SAF-151

Espectrofluorímetro FP-8250

Resultados e Discussão

Espectros de fluorescência

Os espectros de fluorescência obtidos para diferentes concentrações de λDNA marcado com PicoGreen® indicaram que o máximo de emissão ocorre em 523 nm, conforme esperado para esse sistema fluorescente.

O aumento da concentração de DNA resultou em um aumento proporcional da intensidade de fluorescência, demonstrando o comportamento típico de sistemas fluorescentes utilizados em quantificação de ácidos nucleicos.

Figura 1. Espectros de fluorescência do λDNA marcado com PicoGreen®

Curva de calibração

Utilizando os valores médios obtidos para cada concentração, foi construída uma curva de calibração relacionando intensidade de fluorescência e concentração de λDNA.

Figura 2. Curva de calibração do λDNA marcado com PicoGreen®

A regressão linear apresentou:

• Coeficiente de correlação (R): 0,9999

• Erro padrão: 6,819

Esses resultados demonstram excelente linearidade do método, confirmando que o sistema é adequado para quantificação precisa de DNA em uma ampla faixa de concentração.

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