Princípios de espectroscopia Raman(2)
6 de outubro de 2020
Princípios de espectroscopia Raman(4)
6 de outubro de 2020

Princípios de espectroscopia Raman(3)

Medições de espectroscopia Raman

Seleção de laser

A escolha do laser é extremamente importante para o desenvolvimento de um espectro de Raman compreensível. O comprimento de onda de excitação pode ser escolhido desde UV até regiões de radiação visível ou infravermelho próximo, com utilidades interessantes de acordo com a aplicação.

Equipamentos “multilaser” podem ser construídos, de forma que se tenha um sistema de análise mais abrangente. Um comprimento de onda frequentemente utilizado é 532 nm, uma vez que apresenta uma energia de excitação Raman relativamente alta com baixa interferência de fluorescência.

De maneira a reduzir a interferência de efeitos de fluorescência, pode-se utilizar lasers de maior comprimento de ondas como 785 nm e 1064 nm (menos frequentes). Lasers mais raros ainda (no domínio de UV) oferecem informações adicionais de “ressonância Raman”, uma ótima escolha para materiais carbonáceos.

Fluorescência

A fluorescência pode ser considerada como um efeito colateral em medições Raman, originada tanto do analito de interesse quanto da matriz. É importante que se tome cuidado ao se trabalhar com amostras em vials ou tubos, uma vez que estes podem gerar interferências também.

Existem dois métodos físicos para a redução de fluorescência. O primeiro e mais simples, é simplesmente escolher um laser de comprimento de onda maior, incapaz de gerar sinais intensos de fluorescência devido à insuficiência energética para excitação de elétrons. O segundo método é a escolha de uma abertura com tamanho e formato específico, de modo a mascarar a matriz e eliminar seus sinais de fluorescência – isto pode ser melhorado pelo filtro espacial duplo (DSF), incluído em modelos NRS-5000/7000 da Jasco.

Uma terceira opção é a utilização de um algoritmo de rejeição de fluorescência (patenteado), extremamente indicado para a remoção de espectros de fluorescência amplos, permitindo que sinais mais afunilados de Raman sejam observados (figura 8). Estes resultados podem ser obtidos automaticamente ou após reprocessamento de dados já adquiridos. Este algoritmo geralmente apresenta bons resultados para amostras de elevada fluorescência quando se utilizam lasers de baixo comprimento de onda (como 405 nm e 457 nm), que produz um sinal de Raman mais intenso.

Resolução espectral

A resolução espectral em um sistema de microscopia Raman é definida por diversos fatores: distância focal, número de ranhuras na grade de difração e resolução dos elementos no detector. A distância focal é dada pela distância entre o espelho focal e o detector, com uma maior distância focal apresentando maior resolução.

A grade é um componente ótico que consiste em ranhuras periódicas com um ângulo específico (ângulo de blazing) para coincidir com o comprimento de onda de excitação do laser. A resolução aumenta de acordo com o aumento de ranhuras. Geralmente uma grade é determinada pelo número de ranhuras na superfície por milimetro (ex: 900 gr/mm) e o comprimento de onda de trabalho. Devido a limitações físicas, não é possível aumentar indefinidamente o número de ranhuras de forma a aumentar a resolução espectral. A luz que atinge a superfície da grade é dispersa segundo o princípio de Huygens–Fresnel.

O último fator que define a resolução espectral é o tamanho de pixel do detector CCD, com pixels menores sendo responsáveis por maiores resoluções espectrais.

Detector CCD

Um dispositivo de carga acoplada (CCD) é o detector mais comum em microscopia Raman. É um detector de fótons altamente sensível. Imagens são confeccionadas a partir do sinal coletado por diferentes pixels, que são regiões discretas, pequenas e sensíveis na superfície de um detector. Pixels menores levam a resoluções maiores, porém também geram menor sensibilidade. Detectores de multiplicadores de elétron (EMCCD) também são utilizados e oferecem sensibilidade de até 50 vezes em relação a um detector CCD convencional. Para medições de IV próximo, detectores CCD não são suficientemente sensíveis, sendo assim emprega-se o detector de InGaAs.

Resolução espacial

Em microscopia Raman, resolução espacial é extremamente importante, de modo a permitir a discriminação de pequenas diferenças estruturais entre moléculas. Lentes objetivas de um microscópio ótico (até magnitudes de aproximadamente X100) são utilizadas para observar amostras e transmitir a luz oriunda do espalhamento Raman para o espectrômetro. Isto significa que muitos dos fatores e técnicas que afetam a luz na microscopia, podem ser aplicados à microscopia Raman. Resolução espacial está ligada ao poder de resolução de uma lente objetiva. Quando luz com uma distribuição de energia constante é introduzida através de uma lente objetiva, o padrão de difração obtido pela figura 11 pode ser observado. A região central intensa é chamada de disco de Airy, seu diâmetro “d” pode ser determinado pelo comprimento de onda (l) e a abertura numérica (NA), como determina a equação na figura 11. O termo “d” se refere ao limite de difração que determina a resolução espacial de uma lente ótica.

A definição de resolução espacial (critério de Rayleigh, figura 12) no plano XY é baseado na distância entre dois pontos próximos que podem ser distinguidos. Em uma configuração padrão de um NRS-5000/7000 (laser de 532 nm, com lentes objetivas x100 e NA=0.90), o diâmetro “d” observado pela projeção do laser em seu limite de difração é calculado como d=720 nm. A resolução espacial, de acordo com o critério de Rayleigh, é igual a 360 nm. Como a equação na figura 11 sugere, se o comprimento de onda do laser é reduzido, aumenta-se a resolução espacial. Adicionalmente, se uma lente objetiva imersa em óleo, que promove maior NA, é utilizada, pode-se atingir um aumento de resolução espacial. No entanto, a definição baseada em FWHM (largura total à meia altura) da intensidade do anel de interferência também deve ser reconhecida.

Sistema ótico confocal

O diâmetro “d” observado pela projeção do laser é tipicamente menor que 1 μm. O design confocal otimizado do NRS-5000/7000 inclui uma característica adicional: filtro espacial duplo (DSF), o que permite que se alcance máxima resolução espacial. A tecnologia DSF elimina a luz dispersa que não é removida na primeira abertura e melhora significativamente a resolução ao longo do eixo Z (figura 13).

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